Membrana nanoporosa magnetica elettrodepositata per alta

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1358 (2022) Citare questo articolo

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Le nanosfere superparamagnetiche offrono numerosi vantaggi rispetto alle microsfere per l'immunocattura di nanovettori (vescicole extracellulari, lipoproteine e virus) in un test biologico: cattura ad alto rendimento, riduzione del tempo di incubazione e maggiore capacità di cattura. Tuttavia, le nanosfere sono difficili da "abbattere" perché la loro caratteristica superparamagnetica richiede elevati gradienti di campo magnetico su scala nanometrica. Qui, viene mostrato che una membrana elettrodepositata con traccia incisa produce un esclusivo anello nano-bordo superparamagnetico con più bordi attorno ai nanopori. Con un campo magnetico esterno uniforme, il monopolo e il dipolo indotti di questa giunzione nano-edge si combinano per produrre una forza di intrappolamento delle nanosfere 10 volte superiore. Una sospensione densa di nanosfere può essere filtrata attraverso la membrana nanoporosa magnetica (MNM) ad alta produttività con una velocità di cattura delle sfere del 99%. La resa di nanovettori specifici in mezzi eterogenei mediante nanosfere/MNM supera l'80%. Sono inoltre dimostrati la riproducibilità, la bassa perdita e i tassi di cattura indipendenti dalla concentrazione. Questo materiale MNM espande quindi l'applicazione dell'immunocattura di nanosfere ai campioni fisiologici.

Le vescicole extracellulari (EV) e le lipoproteine sono nanoparticelle biologiche che possono essere trovate in vari fluidi biologici1,2,3. La loro funzione recentemente scoperta di trasportare carico molecolare tra le cellule ha catalizzato una notevole attività di ricerca in molti campi4,5. Questi nanovettori biologici possono essere mediatori critici della comunicazione intercellulare6,7. Pertanto, EV specifici, lipoproteine e i loro carichi molecolari sono anche potenziali biomarcatori di malattie8,9,10. Tuttavia, questi biomarcatori spesso non sono esclusivi delle cellule malate ma sono semplicemente sovraespressi. Pertanto è necessaria una quantificazione precisa. A causa delle loro dimensioni ed eterogeneità, l'isolamento ad alto rendimento di specifici EV e lipoproteine rimane impegnativo e può introdurre errori sostanziali nel test dei biomarcatori11,12,13,14,15. Anche gli EV e le lipoproteine tendono a degradarsi, ad aggregarsi o ad essere assorbiti in molti dispositivi16,17. Pertanto, l'isolamento immediato e a breve contatto è preferito rispetto alla citometria a flusso e alla separazione cromatografica, i cui processi di pretrattamento/separazione sono lunghi e complessi. Un metodo di isolamento efficace, rapido e accessibile è quindi un prerequisito per qualsiasi applicazione clinica che coinvolga EV e lipoproteine. I progressi nelle tecnologie di cattura ad alto rendimento sono vantaggiosi in molti ambiti biomedici, compreso il rilevamento di virus o batteri patogeni.

Il metodo più specifico per l'isolamento di EV e lipoproteine è l'immunocattura;18,19,20 tuttavia, le tradizionali tecnologie di immunocattura, come l'immunoprecipitazione (IP) e la cromatografia di immunoaffinità, presentano problemi di bassa resa dovuti alla saturazione della sonda e alla perdita di analiti. Se i nanovettori sono etichettati in modo fluorescente, quelli catturati dalle microsfere magnetiche possono essere selezionati e quantificati mediante citometria a flusso. Tuttavia, il processo di etichettatura e isolamento richiede molto tempo e potrebbe richiedere più di un giorno per ottenere la resa ottimale, con conseguente significativa perdita di nanocarrier. La loro produttività è inoltre limitata dal lungo tempo di incubazione (8-48 ore) a causa della bassa mobilità delle microsfere per la reazione di docking limitata dal trasporto. Una soluzione ai problemi di resa e tempo di incubazione consiste nell'utilizzare sfere nanomagnetiche. La loro ampia superficie per volume fornisce più siti di legame. Le loro dimensioni più piccole portano ad una maggiore diffusività e ad un tempo di incubazione più breve (~ 30 minuti). Le sfere possono anche diffondersi attraverso un campione fisiologico eterogeneo per catturare specifici bersagli di nanoparticelle che hanno mobilità ridotta a causa della complessificazione o dell'aggregazione. La loro ampia area superficiale per volume fornisce più sonde leganti di un fattore pari al rapporto tra i raggi microsfere/nanosfere (~ 100) per la stessa concentrazione di peso delle sfere. Questo aumento del numero di sonde può portare al completo esaurimento di tutti i nanoportatori target, in particolare se le sonde anticorpali hanno un'elevata affinità, fornendo così una resa di legame dei nanoportatori più elevata di ordini di grandezza.

4 ×) trapping is necessary to produce >90% yield. A magnetic film can produce a higher field penetration length than a magnetic bead due to its non-focusing (non-radial) geometry. Recently, Issadore and colleagues developed a magnetic layer-coated nanoporous membrane with improved capture yield, but multiple layers of membranes are still required for efficient bead capture22. Although the field is long-range, the field gradient is not for a planar magnetic film, except at corners. In our earlier work on electric fields at microchannels23 and nanopores24, we showed that a singular electric field with a high gradient occurs in the high-permittivity (water) side of a wedge corner of a channel or a pore if the wedge angle α of the higher permittivity phase exceeds π. This wedge singular field decays radially from the wedge tip with a power-law scaling of −(π/α) − 1 and hence also has a high-field gradient. The radial decay exponent is bound between −2 of a sphere and −3/2 of an infinitely long cylinder. This singular wedge mode is antisymmetric around the wedge and introduces a dipole in the high-permittivity phase. There is a more well-known "lightning rod" wedge singularity in near-field plasmonics25,26,27 that is symmetric around the wedge, with the singular field occurring on the low-permittivity side. It occurs when the high-permittivity side has a wedge angle that is less than π. It introduces a monopole on the low-permittivity side of the wedge. Herein, we extend this concept to magnetic fields to achieve high-yield capture of superparamagnetic beads with high throughput. We designed a multi-edge superparamagnetic NiFe nanoedge with a heterogeneous junction, whose edges sustain both a magnetic monopole and dipole around each nanopore of a nanoporous polymer membrane. This approach will significantly increase the capture yield of one membrane to 99% at a throughput of 5 mL/h for a single magnetic nanoporous membrane (MNM)./p>80% of HDL is recovered using the method, nearly doubling the recovery rate for commercial kits. We also demonstrated that MNM has a high and consistent yield and hence, can provide the necessary statistics for quantifying biomarkers carried by EVs and lipoproteins in heterogeneous physiological fluids (Fig. 1c)./p>99% of the beads were captured. The bead capture efficiency did not diminish even at a flow rate of 5 mL/h. This throughput is high enough for most extracellular vesicle immunocapture applications. Furthermore, only 13% of the beads were lost when the flow rate was increased to 10 mL/h. For membranes with 1-μm pore size, the bead capture efficiency was still >80% at 1 mL/h. In stark contrast, only 22% of beads were captured by the sputtered 450-nm membrane (Fig. 3e). For larger vesicles above 300 nm, electroplated MNM with 1μm pore size can be used at a lower flow rate or with a higher external magnetic field./p>80% of HDL was recovered using this approach. To confirm the specificity of the immunocapture and non-specific adsorption in our device, two negative controls were tested. If no antibodies were functionalized onto the nanobeads in the experiments, <10% of HDL was lost in the device, which was due to non-specific adsorption and experimental error. When antibodies (Abcam, ab139401, rabbit monoclonal to ApoB) against apolipoprotein B, the structural protein for low-density lipoproteins (LDL), were used instead of anti-ApoA-I, the loss increased to 14%. The additional 4% loss may come from the non-specific capture of HDL by anti-ApoB. In both negative controls, the non-specific capture rate of <15% is significantly lower than the specific capture rate of 80%. We benchmarked our method to a commercial immunocapture kit using their standard protocol (see Supplementary Note 5). As shown in Fig. 4c, for nanobeads, only 20% HDL was captured by the μColumn (Milyteni Biotec) because of the low bead capture efficiency of the packed column. Furthermore, for microbeads like Dynabeads™, even after 16 h of incubation, which is much longer than the standard protocol, the HDL capture efficiency does not exceed 50%. For the same incubation time of 1 h as the nanobeads, only 25% HDL was recovered (Supplementary Fig. S4), marginally >15% non-specific capture rate./p>80% of HDL particles recovered and minimal non-specific retention at less than 15%. The high and consistent yield of our system provides quantification potential for studies of EVs, lipoproteins, and other extracellular RNA carriers. We further demonstrated the performance of MNM in exosome capture, purification of HDL-enriched EV samples, and EGFR-positive EVs characterization. The direct lysis protocol in this study is applicable to a variety of downstream analyses for biomarker discovery and diagnostics, such as qRT-PCR, MS-based proteomics, sequencing, etc. For drug delivery, tissue engineering, and other applications requiring intact EVs as carriers, an EV-releasing protocol is necessary. Dissociation buffers36,37, photo-cleavable linker38, and protease-sensitive linkers39 are potential strategies to detach the EVs from the MNM. Our platform is also applicable for other molecular or virus immunocapture applications where capture efficiency and throughput are essential. In addition to the isolation of specific EVs from plasma for liquid biopsy applications (disease screening and therapy management), the MNM technology should also be useful for biomarker discovery from cell cultures, as we have demonstrated here for the DiFi sample, and also for organ-on-the-chip or organoid models35,40,41,42./p>

4 buffer changes and concentrated with 3000 Da m.w. cutoff filters (Millipore). Total protein levels were determined for each lipoprotein sample (HDL and LDL) by BCA colorimetric assays (Pierce, ThermoFisher)./p>