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Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 7741 (2022) Citare questo articolo

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La qualità inadeguata dell’acqua potabile è tra le principali cause di mortalità prevenibile, soprattutto tra i bambini piccoli. Identificare le fonti d’acqua contaminate rimane una sfida significativa, soprattutto dove le risorse sono limitate. Gli attuali metodi per misurare l'Escherichia coli (E. coli), l'indicatore preferito dall'OMS per misurare la contaminazione fecale dell'acqua, prevedono l'incubazione notturna e richiedono una formazione specializzata. Nel 2016, l’UNICEF ha pubblicato un Target Product Profile (TPP) per incentivare le innovazioni di prodotto al fine di rilevare bassi livelli di E. coli vitale nei campioni di acqua sul campo in meno di 6 ore. Spinti da questa sfida, abbiamo sviluppato un test basato sui fagi per rilevare e semi-quantificare l'E. coli. Abbiamo formulato un cocktail di fagi contenente un totale di 8 fagi selezionati rispetto a un'ampia libreria di ceppi batterici e ricombinati con il sensibile reporter della luciferasi NanoLuc. Il test è stato ottimizzato per essere elaborato in un chip microfluidico progettato internamente ed è stato testato su campioni di liquami di provenienza locale e su fonti di acqua potabile a Nairobi, in Kenya. Con questo test, combinato con la piattaforma di chip microfluidico, proponiamo una soluzione automatizzata completa per rilevare e semi-quantificare E. coli a meno di 10 MPN/100 ml in 5,5 ore da parte di personale minimamente addestrato.

L’importanza dell’accesso sostenibile all’acqua potabile continua ad essere fondamentale per ridurre la povertà e migliorare la salute e il benessere della popolazione mondiale. Nonostante siano stati compiuti progressi verso gli Obiettivi di sviluppo sostenibile e la loro attenzione al miglioramento dell’accesso all’acqua sicura (SDG 6)1, la qualità di molte risorse idriche rimane incerta. Le malattie diarroiche, dovute principalmente a cibo e acqua contaminati, continuano a essere la seconda causa di morte a livello mondiale tra i bambini sotto i cinque anni, causando l’8% di tutti i decessi globali, con l’80% dei decessi che si verificano nell’Asia meridionale e nella regione sub-sahariana. Africa2. Ispezionare la qualità dell’acqua per individuare la presenza di agenti patogeni che causano la diarrea è vitale per il benessere di milioni di persone.

Uno dei rischi microbici più significativi è associato all'ingestione di acqua contaminata da feci umane o animali3. Sebbene la maggior parte dei coliformi siano innocui per l’uomo, vengono utilizzati nei test per indicare la potenziale presenza di agenti patogeni pericolosi. L'E. coli, in particolare, ha molte caratteristiche ideali di un organismo indicatore poiché deriva quasi esclusivamente da feci umane e animali e comprende alcuni ceppi patogeni (ad es. O157:H7)4. Mentre l’uso di indicatori fecali (coliformi, coliformi termotolleranti, E. coli) è stato criticato poiché la loro presenza implica solo che il rischio di presenza di agenti patogeni è aumentato, il monitoraggio delle centinaia di agenti patogeni conosciuti presenti nell’acqua rimane poco pratico ed estremamente difficile da eseguire rapidamente. e a basso costo4. Inoltre, le informazioni sulla quantità dell'indicatore fecale sono essenziali poiché il rischio di contrarre un'infezione trasmessa dall'acqua aumenta con il livello di contaminazione.

I limiti batterici accettabili sono stati definiti dall’OMS3, tra gli altri, e stabiliscono che tutta l’acqua destinata al consumo umano non deve contenere E. coli o batteri coliformi termotolleranti rilevabili in nessun campione da 100 ml, essendo E. coli l’indicatore preferito. I metodi più utilizzati per rilevare i coliformi nei campioni di acqua sono la filtrazione su membrana, la fermentazione in provette multiple utilizzando il metodo del numero più probabile (MPN) e i test di presenza/assenza come il test dell'idrogeno solforato5. Sebbene questi metodi possano raggiungere una sensibilità di 1 CFU/100 ml tra 0,5 e 7,5 $/test, sono spesso laboriosi, richiedono una formazione specializzata del personale, sono difficili da utilizzare sul campo e richiedono lunghi tempi di incubazione, in genere durante la notte6. Nessun test è in grado di rilevare rapidamente bassi livelli di E. coli vitale nell'acqua in meno di 8 ore7.

109 PFU/mL) and low luminescence background that induce the expression of a high luminescence signal relatively fast (< 3 h) and that are stable at 4 °C. For example, reporter phage Phi7 and T7 have similar luminescence-based host ranges; however, T7 yielded a positive luminescence signal two hours faster and was selected over phage Phi7. The titer of phage T2 decreased by a couple of logs over the course of a few weeks during storage at 4 °C and was not pursued as a candidate for the cocktail. Similarly, the titer of phage T6 was found to decrease during centrifugation steps and was also deprioritized in favor of other phages with better stability during purification. Finally, phage Phi6 was removed early in the process due to poor purification efficiency resulting in high luminescence background levels./p> 1000) or in triplicate (MPN values < 1000) to generate a range of cell concentrations for testing (Fig. 5b)./p> 100./p> 100 E. coli MPN/100 mL (very high contamination). This calibration curve is dependent on the quality of the phage reagents (titer, purity) and would have to be determined for each phage cocktail production lot./p>

109 PFU/mL) were treated with sodium azide (0.05%) to create a storage phage stock solution. Finally, a phage cocktail solution was prepared by mixing stock solutions of eight phages in TSB (each at final concentration 1:80 from stock) and stored at 4 °C until ready to use. The phage titers were stable for at least 6 months./p> 108 PFU/mL) was added to appropriate wells (final well composition: TSB with 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 50 mM Tris–HCl pH 7.5). The plate was incubated for an additional 3 h, after which 100 µL of the culture was transferred to a white 96-well plate, mixed 1:1 with NanoGlo substrate, and incubated at room temperature for 3 min before reading using a plate reader (BioTek Synergy H1, 1 mm read height, 1 s integration)./p> 107 (250 µL). The chip was further incubated (37 °C, 3 h) to allow for phage infection. Vacuum was then applied to transfer the produced NanoLuc-CBM enzyme from the PVDF membrane to the nitrocellulose (NT) capture membrane. Finally, Nano-Glo substrate (75 µL) was added to the chamber below the NT membrane. Luminescence was read immediately, using a custom-built detection assembly with a photomultiplier tube (ET Enterprises, Ltd., Uxbridge, UK)22. The Aquasafe® WSL50 Pro membrane filtration kit (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, UK) was used to quantify CFU's within the river samples, and the Quanti-Tray/2000 system (IDEXX, Westbrook, ME) was used to determine MPN in sewage samples./p>