Morfogenesi 3D in vitro dell'epitelio intestinale umano in un intestino

Nature Protocols volume 17, pagine 910–939 (2022) Citare questo articolo

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La morfogenesi intestinale umana stabilisce la microarchitettura epiteliale 3D e le caratteristiche della cripta-villo organizzate spazialmente. Questa struttura unica è necessaria per mantenere l’omeostasi intestinale proteggendo la nicchia delle cellule staminali nella cripta basale dagli antigeni microbici esogeni e dai loro metaboliti. Inoltre, i villi intestinali e il muco secretorio presentano cellule epiteliali funzionalmente differenziate con una barriera protettiva sulla superficie della mucosa intestinale. Pertanto, ricreare la struttura epiteliale 3D è fondamentale per costruire modelli di intestino in vitro. In particolare, un gut-on-a-chip organomimetico può indurre la morfogenesi 3D spontanea di un epitelio intestinale con funzioni fisiologiche e biomeccaniche migliorate. Qui forniamo un protocollo riproducibile per indurre in modo robusto la morfogenesi intestinale in un gut-on-a-chip microfluidico e in un chip ibrido incorporato in Transwell. Descriviamo metodi dettagliati per la fabbricazione del dispositivo, la coltura di Caco-2 o cellule epiteliali organoidi intestinali in configurazioni convenzionali e su piattaforme microfluidiche, l'induzione della morfogenesi 3D e la caratterizzazione dell'epitelio 3D stabilito utilizzando più modalità di imaging. Questo protocollo consente la rigenerazione della microarchitettura intestinale funzionale controllando il flusso del fluido basolaterale entro 5 giorni. Il nostro metodo di morfogenesi in vitro impiega stress di taglio e movimenti meccanici fisiologicamente rilevanti e non richiede ingegneria o manipolazione cellulare complessa, il che può essere vantaggioso rispetto ad altre tecniche esistenti. Prevediamo che il nostro protocollo proposto possa avere un ampio impatto sulle comunità di ricerca biomedica, fornendo un metodo per rigenerare strati epiteliali intestinali 3D in vitro per applicazioni biomediche, cliniche e farmaceutiche.

È stato dimostrato sperimentalmente che le cellule Caco-2 epiteliali intestinali coltivate in un gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o in un dispositivo microfluidico a doppio strato6,7 possono subire una morfogenesi 3D spontanea in vitro senza una chiara comprensione di il meccanismo sottostante. Nel nostro recente studio, abbiamo identificato che la rimozione degli antagonisti del morfogeno secreti basolateralmente dall'impianto di coltura è necessaria e sufficiente per indurre la morfogenesi epiteliale 3D in vitro, verificata sia con Caco-2 che con epiteli organoidi intestinali derivati dal paziente4. In questo studio, ci siamo concentrati specificamente sulla produzione cellulare e sul profilo di concentrazione di un potente antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), sia in gut-on-a-chip che in un dispositivo microfluidico modificato che contiene un inserto Transwell, chiamato un "chip ibrido". Abbiamo confermato che le aggiunte esogene di antagonisti Wnt (ad esempio, DKK-1, fattore inibitorio Wnt 1, proteina 1 secreta correlata al frizzled o Soggy-1) in un gut-on-a-chip determinano l'inibizione della morfogenesi o l'interruzione di strati epiteliali 3D prestrutturati, suggerendo che la pressione antagonista durante la coltura è responsabile della morfogenesi intestinale in vitro. Pertanto, gli approcci pratici per una morfogenesi robusta su un'interfaccia epiteliale consistono nel rimuovere o mantenere minimamente il livello degli antagonisti Wnt nel compartimento basolaterale lavandoli via attivamente (ad esempio, nelle piattaforme gut-on-a-chip o ibride) o diffondendo il brodo di coltura basolaterale (ad esempio, dall'inserto Transwell a un grande serbatoio basolaterale nel pozzetto).

In questo protocollo, forniamo metodi dettagliati per fabbricare un microdispositivo gut-on-a-chip e un chip ibrido inseribile Transwell (passaggi 1-5), coltivando cellule epiteliali intestinali su una membrana porosa a base di polidimetilsilossano (PDMS) (passaggi 6A, 7A, 8, 9) o la membrana in poliestere di un inserto Transwell (passaggi 6B, 7B, 8, 9) e inducendo la morfogenesi 3D in vitro (passo 10). Identifichiamo anche caratteristiche cellulari e molecolari che sono indicative dell'istogenesi tessuto-specifica e della citodifferenziazione dipendente dal lignaggio applicando più modalità di imaging (passaggi 11-24). Induciamo la morfogenesi utilizzando cellule epiteliali intestinali umane come Caco-2, o organoidi intestinali, in entrambi i formati di coltura con dettagli tecnici tra cui la modifica della superficie di una membrana porosa, la creazione di un monostrato 2D e la ricapitolazione del microambiente biochimico e biomeccanico dell'intestino in vitro. Per indurre la morfogenesi 3D da un monostrato epiteliale 2D, rimuoviamo gli antagonisti del morfogeno in entrambi i formati di coltura facendo scorrere il mezzo di coltura nel compartimento basolaterale delle colture. Infine, forniamo esempi rappresentativi dell'utilità degli strati epiteliali 3D rigenerativi che possono essere potenzialmente utilizzati per simulare la crescita epiteliale morfogeno-dipendente, le co-colture longitudinali ospite-microbioma, l'infezione da agenti patogeni, le lesioni infiammatorie, le disfunzioni della barriera epiteliale e le terapie a base di probiotici. effetto.

95% coverage in a flask) to prepare a dissociated cell suspension by trypsinization (Box 2). Human intestinal organoids derived from intestinal biopsies or surgical resections are cultured in a dome of Matrigel scaffold plated in a 24-well plate to support the structural microenvironment. Culture medium that contains essential morphogens (e.g., Wnt, R-spondin and Noggin) and growth factors, prepared as described in Box 3, is replenished every other day until the organoids grow up to ~500 µm in diameter. Fully grown organoids are harvested and dissociated into single cells for a seeding into a gut-on-a-chip or on a Transwell insert (Box 5). As we previously reported, diverse intestinal organoid lines can be established and used depending on the disease type12,13 (e.g., ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer or normal donors), the site of lesion (e.g., diseased versus nondiseased region) and the location in the GI tract (e.g., duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon or rectum). We provide an optimized protocol in Box 5 for culturing colonic organoids (colonoids) that typically require a higher concentration of morphogens than small intestinal organoids./p>

4 h./p>4 h./p>12 h to make a complete gut-on-a-chip device (Fig. 2f)./p>4 h to produce a complete hybrid chip device (Fig. 2h)./p>90% that does not cause any leakages due to the misalignment. However, the success rate may vary depending on the level of proficiency in the fabrication process and training. See Table 1 for troubleshooting./p>