Identificazione di piccole molecole in grado di potenziare la fusione della membrana virale

Virology Journal volume 20, numero articolo: 99 (2023) Citare questo articolo

359 accessi

2 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Sono stati sviluppati diversi approcci per analizzare l’ingresso di virus altamente patogeni. In questo studio, riportiamo l’implementazione di un test di complementazione multicellulare bimolecolare (BiMuC) per monitorare in modo sicuro ed efficiente la fusione della membrana mediata da SARS-CoV-2 senza la necessità di apparecchiature basate sulla microscopia. Utilizzando BiMuC, abbiamo esaminato una libreria di farmaci approvati e identificato composti che migliorano la fusione della membrana cellulare mediata dalla proteina S. Tra questi, l’etinilestradiolo promuove la crescita del virus SARS-CoV-2 e dell’influenza A in vitro. I nostri risultati dimostrano il potenziale di BiMuC per identificare piccole molecole che modulano il ciclo di vita dei virus con involucro, incluso SARS-CoV-2.

La nuova sindrome respiratoria acuta grave coronavirus-2 (SARS-CoV-2) [1, 2] ha causato la malattia pandemica nota come malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). Questa malattia ha avuto e continua ad avere un impatto enorme sui nostri sistemi sanitari e sull’economia globale. Di conseguenza, sono stati compiuti sforzi straordinari per sviluppare misure profilattiche e terapeutiche per ridurre la morbilità e la mortalità associate alla malattia COVID-19.

La membrana cellulare è la prima barriera che il virus incontra quando infetta una nuova cellula. Ad un certo punto durante l’ingresso, i virus avvolti devono fondere le membrane cellulari e virali. Nel caso della SARS-CoV-2, la proteina spike (S) altamente glicosilata è responsabile dell’ingresso nelle cellule ospiti [3]. La proteina S, una proteina di fusione trimerica di classe I [4], è tradotta in una forma non attiva (S0). L'attivazione proteolitica di S0 da parte delle proteasi dell'ospite (cioè TMPRSS2) produce la proteina S matura pre-fusione incorporata nei virioni [5]. Il processo infettivo inizia con il legame della proteina S all’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2) sulla superficie cellulare [2, 6]. Il legame con ACE2 innesca un cambiamento conformazionale, con conseguente esposizione del peptide di fusione della proteina S, che interagirà con la membrana ospite e avvierà la fusione delle membrane virali e cellulari. Facilitare una qualsiasi delle molteplici fasi di questo complesso processo accelererebbe e aumenterebbe la produzione virale, accelerando lo sviluppo del vaccino tradizionale, riducendo i costi di produzione e aumentando la resa di produzione [7].

Sono stati sviluppati molteplici approcci per analizzare in modo sicuro l'ingresso virale, inclusi test basati su virus pseudo-tipizzati, test basati su particelle simili a virus, test biochimici o test di fusione cellula-cellula. L'identificazione del sincizio, a causa dell'espressione del meccanismo di fusione virale e del corrispondente recettore ospite sulla superficie cellulare, è stata tradizionalmente effettuata mediante microscopia. Tuttavia, le metodologie basate sul microscopio ostacolano la quantificazione del processo di fusione e l'implementazione di metodi ad alto rendimento per l'identificazione di piccole molecole.

Per studiare il processo di fusione della membrana mediato da SARS-CoV-2 S, abbiamo deciso di adattare il test di complementazione multicellulare bimolecolare (BiMuC) recentemente sviluppato [8]. Basato sulle proprietà di complementazione bimolecolare di una proteina reporter fluorescente, questo test facilita l'identificazione e la quantificazione degli eventi di fusione cellula-cellula indotti dal virus senza l'ausilio di apparecchiature basate sul microscopio. Dopo aver ospitato BiMuC per lo studio di SARS-CoV-2, abbiamo allestito uno schermo per piccole molecole in grado di modulare il processo di fusione della membrana mediato dalla proteina S. Abbiamo analizzato 1280 piccole molecole, utilizzando questo test, e identificato che l'etinilestradiolo migliora la fusione della membrana cellula-cellula mediata dalla proteina S. Di conseguenza, l’etinilestradiolo aumenta la crescita di SARS-CoV-2 in vitro. Inoltre, l’effetto sulla fusione della membrana mediata dal virus non è limitato alla SARS-CoV-2. Abbiamo dimostrato che l’etinilestradiolo potrebbe aumentare la crescita del virus dell’influenza A e la fusione della membrana del virus Nipah. I nostri risultati mostrano che BiMuC potrebbe essere implementato per monitorare il processo di fusione della membrana SARS-CoV-2 e identificare piccole molecole che perturbano questo processo.

1.5. Hits were confirmed in secondary screening. This time cells included the pRL-Renilla. The luminescence was measured using the Renilla Luciferase Assay kit from Sigma following the manufacturer protocol on 96-well white cell-culture plates. This measure facilitates the elimination of those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. To discard the hits that had fluorescent properties similar to VFP, cells were seeded in black 96-well plates and treated with the compounds under the same conditions as described above. In this case, fluorescence was measured as before (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). In all assays, [DMSO] was kept at ≤ 1%. Statistical analysis was done with Libre Office Calc./p> 1.5 (Table S1). Hits were re-tested using the same experimental conditions and selection criteria. Only the compounds capable of enhancing viral fusion in both rounds were considered (Fig. 2B). Additionally, we measured the luminescence from the Renilla luciferase and eliminated those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. We also tested the fluorescence properties of the remaining hits and discarded those compounds emitting near 530 nm (Fig. 2B)./p>